La fototoxicidad se caracteriza por la capacidad de ciertas moléculas inocuas para volverse tóxicas cuando se las ilumina adecuadamente. Para descubrir nuevas drogas fotoactivas o caracterizar contaminantes fototóxicos, sería muy útil implementar pruebas biológicas simples de fototoxicidad. En este trabajo, se evaluaron los potenciales efectos fototóxicos de 37 colorantes en el nematodo Caenorhabditis elegans.
Materiales Y Métodos:
Para el ensayo de fototoxicidad, se cultivaron poblaciones sincronizadas de la cepa SS104 (glp-4 [bn2], un mutante de C.elegans con fenotipo estéril sensible a la temperatura) a temperatura no permisiva (25ºC) en medio de crecimiento de nematodos. En el primer día de la etapa adulta, los animales se lavaron dos veces en solución salina (medio K modificado: NaCl 52 mM y KCl 32 mM [41] + Triton X-100 al 0,01%) y se transfirieron a microplacas de 96 pocillos de fondo plano. Se utilizó un promedio de 50 animales / 100 μl volumen final por pocillo. Una hora después del pipeteo, se evaluó la motilidad basal de los animales utilizando un dispositivo de lectura infrarrojo (WMicrotracker). Esta actividad basal se registró para normalizar cualquier variación de actividad, eliminando las diferencias entre los pocillos debido a posibles variaciones en la población. Luego de la medición basal, se agregaron los distintos colorantes al medio de cultivo en concentraciones finales de 0.1, 1, 10 o 100 μM y se incubaron durante 1 hora antes de ser irradiadas con luz. La fotoactivación de los colorantes se llevó a cabo por exposición de las microplacas durante 30 minutos a una fuente de luz blanca fluorescente (lámpara fluorescente blanca 2700ºK R7s 20W, Sica, Argentina) a 10 mW / cm2 de intensidad. Se utilizó un filtro IR de (3 cm de ancho) para evitar el calentamiento de la placa. La prueba de concepto se realizó con dos colorantes bien caracterizados, Luxol fast blue (no fototóxico) y Rose Bengal (una molécula fotoactiva), luego de ello se testearon otros 35 colorantes. La actividad locomotora se registró continuamente en condiciones de oscuridad durante la incubación con el colorante y durante 4 horas después de la activación del colorante. Se usaron al menos 4 réplicas (pocillos) para cada experimento.
Resultados:
En la puesta a punto del ensayo fototóxico se observó una reducción significativa en la actividad locomotora en el control positivo (rosa de Bengala) que permaneció baja incluso después de 4 horas del pulso de luz. Inesperadamente, también se observó una respuesta inmediata en la muestra control (sin colorantes) y en el control negativo (Luxol fast blue) justo después de la irradiación de la luz, posiblemente como una respuesta transitoria a la luz (Figura 1A). Ninguno de los colorantes causó un efecto sin irradiación de luz (Figura no mostrada).
Los 37 colorantes seleccionados para evaluar los efectos fototóxicos se probaron en cultivos de C.elegans. Como resultado, 16 de los compuestos presentaron efectos fototóxicos inmediatos y 8 presentaron efectos fototóxicos tardíos (Tabla 2). En orden decreciente de efecto fototoxico, los 5 mejores colorantes fueron Phloxine B> Primuline> Eosin Y> Acridine orange> Rose Bengal. Muchos de estos colorantes han sido reportados previamente como fototóxicos, siendo estos datos consistentes con nuestros resultados.
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PLoS One. 2015 Jun 3;10(6):e0128898. doi: 10.1371/journal.pone.0128898. eCollection 2015.
Javier Ignacio Bianchi, Juan Carlos Stockert, Lucila Ines Buzz1, Alfonso Blázquez- Castro, Sergio Hernán Simonetta