El nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un modelo biológico experimental ventajoso que permite acelerar el descubrimiento de nematicidas. En este trabajo, se reporta el testeo de una biblioteca de drogas utilizando un ensayo de C. elegans, basado en un lector automatizado de motilidad infrarroja. Como prueba de concepto, se seleccionó la biblioteca «Pathogen Box» y se obtuvieron resultados similares a los obtenidos anteriormente con Haemonchus contortus. Luego, se seleccionó una biblioteca interna conteniendo compuestos de diversas familias. Los resultados muestran nuevos potenciales nematicidas y reflejan el valor de C. elegans para acelerar la búsqueda de nematicidas utilizando un ensayo automatizado sencillo y que permite realizar registros durante la noche.
Materiales y Métodos
Se recolectaron de la placa C.elegans sincronizados en estadio L4 y se lavaron tres veces con solución salina K (NaCl 51 mM, KCl 32 mM) mediante centrifugación a 1000 g. Los gusanos se transfirieron a microplacas de 96 pocillos (Costar). Por pocillo se colocó aproximadamente 60 gusanos en 80 ul de solución salina K conteniendo 0,015% de albúmina de suero bovino (BSA). El movimiento basal se midió durante 30 minutos para normalizar la actividad de movimiento del 100% para cada pocillo al comienzo del ensayo. Luego, las drogas se agregaron a un volumen final de 100 ul por pocillo. Se llevó a cabo un ensayo dosis dependiente de ivermectina en el rango de 0.01 a 10 um en DMSO al 1%. El rango de concentración del ensayo de dosis-respuesta de levamisol fue de 1 a 1000 um. No se usó DMSO en los ensayos de levamisol. La motilidad, utilizando WMicrotracker One, se midió durante 90 min. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, los compuestos de la “Pathogen Box” se agregaron a una concentración final de 50 um en DMSO al 1% en un volumen final de 100 uL por pocillo. Los pocillos control con el vehículo se analizaron por octuplicado. La motilidad (utilizando WMicrotracker ONE) se midió durante 17,5 h. Los positivos fueron re evaluados utilizando el mismo método. La respuesta de la motilidad dependiente de la dosis para tolfenpyrad se llevó a cabo en el rango de 2 a 30 um en DMSO al 1%.
Resultados
Inicialmente, se testearon dos nematicidas disponibles comercialmente (ivermectina y levamisol) conocidos por su acción letal por parálisis a través de diferentes mecanismos. Las curvas de dosis-respuesta obtenidas para ambos compuestos (Figura 3) mostraron claramente que el ensayo era adecuado para detectar fármacos que afectan la motilidad. La EC50 fue de 0.19 ± 0.01 um para la ivermectina y 6.4 ± 0.3 um para el levamisol. Tolfenpyrad fue el compuesto identificado de la biblioteca cuando se testeo en estadios larvales de H. contortus estadío L3 y L4. La curva de dosis-respuesta mostró que tolfenpyrad estaba completamente activo a una concentración tan baja como 10 um (Figura 4b), con un EC50 de 3.6 ± 0.2 um. Los gusanos tratados con tolfenpyrad fueron examinados bajo un microscopio estereoscópico y se observó un fenotipo letal claro.
Vet Sci. 2019 Mar 17;6(1). pii: E29. doi: 10.3390/vetsci6010029.
Risi G, Aguilera E, Ladós E, Suárez G, Carrera I, Álvarez G, Salinas G